TRIzol法是RNA提取的金標(biāo)準(zhǔn)方法，由Chomczynski和Sacchi在1987年首-次描述，至今仍是實(shí)驗(yàn)室常用的技術(shù)之一。它基于酸性酚-異硫氰酸胍單相裂解系統(tǒng)，能高效裂解細(xì)胞并抑制RNase活性。本文將為您詳細(xì)拆解TRIzol法提取RNA的每一步，并指出操作中的關(guān)鍵注意事項(xiàng)，助您成功獲得高質(zhì)量RNA。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

樣本：已處理好的組織勻漿或細(xì)胞裂解液（每50-100 mg組織或1×10?細(xì)胞加入1 mL TRIzol）。

試劑：氯仿、異丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free水。

耗材：RNase-free的1.5 mL離心管、槍頭。

儀器：低溫離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器。

詳細(xì)操作步驟與關(guān)鍵注意事項(xiàng)

第-步：相分離

將裝有TRIzol裂解液的樣品室溫孵育5分鐘，使核蛋白復(fù)合物完-全解離。

加入氯仿：按每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿的比例加入氯仿。

劇烈混勻：蓋緊離心管蓋，用手用力上下?lián)u晃15秒，使溶液充分乳化為粉紅色均一液體。

【關(guān)鍵點(diǎn)1】 ：切勿使用渦旋振蕩器，渦旋可能導(dǎo)致DNA斷裂并污染RNA。必須用手劇烈搖晃，確保兩相充分接觸。

【關(guān)鍵點(diǎn)2】 ：混勻不徹-底會(huì)嚴(yán)重影響RNA的得率和純度。

室溫孵育2-3分鐘。

離心：4°C，12,000g，離心15分鐘。

觀察分層：離心后，混合物分為三層：

上層無(wú)色水相：含RNA（約占總體積的50-60%）。

中間白色相層：含DNA和蛋白質(zhì)。

下層紅色有機(jī)相：含蛋白質(zhì)和酚。

第二步：RNA沉淀

小心吸取上層水相：用微量移液器，將槍頭傾斜，小心穿過(guò)上層，沿管壁緩慢吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的RNase-free離心管中。

【關(guān)鍵點(diǎn)3】 ：務(wù)必不要吸取任何中間相物質(zhì)。為防止DNA污染，即使?fàn)奚恍┗厥章?，也只吸取上層水相?/span>80-90%（例如，1 mL TRIzol對(duì)應(yīng)約600 μL水相，建議只吸500 μL）。

加入異丙醇：按每1 mL初始TRIzol用量，加入0.5 mL異丙醇。

混勻：上下顛倒離心管，充分混勻。

【關(guān)鍵點(diǎn)4】 ：混勻不徹-底會(huì)導(dǎo)致RNA無(wú)法有效沉淀。

室溫孵育10分鐘：

可選優(yōu)化：對(duì)于微量RNA樣品（<1 μg），可在此步加入1 μL糖原（20 mg/mL）作為載體，提高沉淀效率。為防止溫度過(guò)高導(dǎo)致降解，也可在冰上或-20°C冰箱中進(jìn)行沉淀。

第三步：RNA洗滌

離心：4°C，12,000g，離心10分鐘。離心后，在管底或管側(cè)可見(jiàn)白色凝膠狀RNA沉淀。

棄上清：小心倒掉上清，或用移液器吸除，注意不要丟失沉淀。

加入75%乙醇洗滌：按每1 mL初始TRIzol用量，加入至少1 mL 75%乙醇。

懸浮沉淀：輕輕渦旋或上下顛倒，使沉淀脫離管壁，懸浮在乙醇中。

【關(guān)鍵點(diǎn)5】 ：這一步的目的是洗去殘留的異丙醇和鹽離子。必須確保沉淀被充分洗滌。

離心：4°C，7,500g，離心5分鐘。

重復(fù)洗滌：棄上清，重復(fù)步驟3-5，共洗滌兩次。

注意：沉淀在75%乙醇中非常穩(wěn)定，可在2-8°C保存至少一周，或-20°C長(zhǎng)期保存。

第四步：RNA溶解

棄盡乙醇：第二次洗滌離心后，小心倒掉上清，用微量移液器將管底殘留的液體吸干。

干燥沉淀：打開(kāi)管蓋，室溫空氣干燥5-10分鐘。

【關(guān)鍵點(diǎn)6】 ：切勿過(guò)度干燥。當(dāng)沉淀由白色不透明變?yōu)榘胪该骰蛲该髂z狀時(shí)，即為干燥完成。過(guò)度干燥的RNA極難溶解。

【關(guān)鍵點(diǎn)7】 ：切勿真空離心干燥，這會(huì)導(dǎo)致RNA不可逆地變性，溶解度大大降低。

溶解RNA：根據(jù)沉淀量，加入20-100 μL RNase-free水。

重懸：用移液槍反復(fù)吹打幾次，使RNA充分溶解。如果RNA過(guò)于干燥，可在55-60°C水浴中溫育10分鐘助溶，但通常不建議加熱，以免加速降解。

結(jié)果檢測(cè)

取少量RNA溶液，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度和純度（A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間），并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。

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