從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總蛋白是最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)操作之一。但貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞因其生長狀態(tài)不同，操作細(xì)節(jié)上有所差異。本文為兩種細(xì)胞類型提供標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOP），并匯總常見問題及解決方案。

一、通用準(zhǔn)備與要點(diǎn)

1. 全程低溫：所有操作在冰上或4℃條件下進(jìn)行，緩沖液預(yù)冷。

2. 抑制劑現(xiàn)加：裂解液使用前立即加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（如需）。

3. 裂解液選擇：根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)選擇（如RIPA用于總蛋白WB，NP-40用于IP）。

4. 裂解液用量參考：

l 6孔板：120-150 μL/孔

l 12孔板：80-100 μL/孔

l 60 mm培養(yǎng)皿：300-400 μL

l 100 mm培養(yǎng)皿：500-800 μL

l 懸浮細(xì)胞（1×10?）：500-800 μL

二、貼壁細(xì)胞總蛋白提取SOP

1. 清洗：棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS輕柔清洗細(xì)胞3次，徹-底吸干殘留液體。

2. 裂解：加入含抑制劑的裂解液，冰上孵育10-20分鐘。期間每5分鐘晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使裂解液覆蓋均勻。

3. 收集：用預(yù)冷細(xì)胞刮快速刮下細(xì)胞，將裂解物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管。

4. 離心：4℃下12,000-14,000 rpm離心20分鐘。

5. 保存：取上清（即總蛋白），分裝，-80℃保存。

關(guān)鍵要點(diǎn)：

l 避免胰酶消化：盡量用刮刀收集細(xì)胞，胰酶可能剪切膜蛋白并激活信號(hào)通路。

l 處理粘稠樣品：若樣品呈粘稠拉絲狀（核酸污染），可在裂解后加入DNase I（10-20 U/mL，含2 mM Mg2?）冰上處理5分鐘，顯著降低粘度。

l 磷酸化蛋白：全程快速操作，從裂解到加入上樣緩沖液變性應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成。

三、懸浮細(xì)胞總蛋白提取SOP

l 收集細(xì)胞：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，室溫300-500×g離心5分鐘，棄上清。

l 清洗：用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，相同條件離心洗滌2次，棄上清，留下緊實(shí)細(xì)胞沉淀。

l 裂解：按細(xì)胞量加入冰冷裂解液，用移液器輕柔但充分吹打10-15次，重懸沉淀。

l 孵育：冰上孵育10分鐘。對(duì)于難裂解細(xì)胞，可進(jìn)行短時(shí)超聲（1秒開/2秒停，共5-10次）。

l 離心：4℃下12,000-14,000×g離心10-15分鐘。

l 保存：取上清，BCA定量后，加入上樣緩沖液95℃變性5分鐘，分裝-80℃保存。

關(guān)鍵要點(diǎn)：

l 紅細(xì)胞污染：若樣本為血液或含紅細(xì)胞，先用紅細(xì)胞裂解液（RBC lysis buffer） 室溫處理1-2分鐘，離心棄上清后再進(jìn)入洗滌步驟。

l 細(xì)胞量少：可適當(dāng)減少裂解液體積以提高蛋白濃度。

l 顆粒物多：如漿細(xì)胞系，超聲步驟不可少，能顯著提高提取效率。

四、常見問題與解決方案

五、總結(jié)

遵循標(biāo)準(zhǔn)化的SOP，根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整操作細(xì)節(jié)，并警惕常見問題，能極大提高蛋白提取的成功率和重復(fù)性。對(duì)于新手而言，從貼壁細(xì)胞使用RIPA裂解液開始是較為穩(wěn)妥的選擇，逐步積累經(jīng)驗(yàn)后再優(yōu)化條件。

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