在分泌型蛋白或跨膜蛋白的研究里，FLAG 標(biāo)簽因?yàn)樘禺愋院?、洗脫條件溫和，一直挺受歡迎的。但有個(gè)現(xiàn)象特別讓人頭疼：qPCR 跑出來(lái) mRNA 轉(zhuǎn)錄水平很高，可一到 Western blot，用 FLAG 抗體死活檢測(cè)不到蛋白信號(hào)。這時(shí)候很多人會(huì)反應(yīng)是抗體有問(wèn)題，但其實(shí)很多時(shí)候，問(wèn)題出在 FLAG 標(biāo)簽和信號(hào)肽“打架"上了。

問(wèn)題根源：標(biāo)簽干擾了信號(hào)肽的功能

信號(hào)肽是分泌蛋白 N 端一段大約 15-30 個(gè)氨基酸的小片段，它的任務(wù)就是引導(dǎo)蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，啟動(dòng)分泌通路。想要正常工作，信號(hào)肽的疏水核心區(qū)得和 SRP（信號(hào)識(shí)別顆粒）精準(zhǔn)對(duì)上才行。

但如果你把 FLAG 標(biāo)簽直接加在蛋白的 N 端，這個(gè)標(biāo)簽的剛性結(jié)構(gòu)很可能就正好蓋在信號(hào)肽的疏水核心區(qū)上，或者擠在旁邊造成空間位阻。結(jié)果就是：

l SRP 顆粒認(rèn)不出信號(hào)肽；

l 信號(hào)肽酶切不下去；

l 蛋白要么運(yùn)不出去，要么直接被降解掉。

驗(yàn)證與解決方案

1. 驗(yàn)證是否為標(biāo)簽位置問(wèn)題

l 標(biāo)簽移位：將FLAG標(biāo)簽從N端移至C端，重新構(gòu)建表達(dá)載體，檢測(cè)蛋白表達(dá)與分泌情況。

l 標(biāo)簽切除：通過(guò)酶切去除FLAG標(biāo)簽，觀察蛋白是否恢復(fù)分泌。
若上述操作后蛋白可被正常檢測(cè)，則證明問(wèn)題確由N端FLAG標(biāo)簽與信號(hào)肽沖突引起。

2. 優(yōu)化方案

l 添加柔性連接肽：若無(wú)法更改標(biāo)簽位置（如C端無(wú)可用位點(diǎn)），可在信號(hào)肽與FLAG標(biāo)簽之間插入一段柔性連接肽，如 GGGSGG。連接肽可拉開(kāi)兩者空間距離，減少相互干擾。

l 更換小尺寸標(biāo)簽：將FLAG標(biāo)簽替換為體積更小的標(biāo)簽（如HA標(biāo)簽），降低空間位阻效應(yīng)。

總之，遇到 FLAG 標(biāo)簽檢測(cè)不到分泌蛋白的情況，別急著懷疑抗體，先看看標(biāo)簽是不是放錯(cuò)了地方。把位置調(diào)一調(diào)，或者稍微做點(diǎn)結(jié)構(gòu)上的微調(diào)，問(wèn)題通常就能解決。

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