懸浮細(xì)胞因其在培養(yǎng)液中均勻分布、無(wú)需消化即可直接收集的特點(diǎn)，在多種下游實(shí)驗(yàn)中具有先天優(yōu)勢(shì)。本章節(jié)將聚焦懸浮細(xì)胞常用的兩大下游實(shí)驗(yàn)——流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與RNA提取，系統(tǒng)梳理從樣品制備到實(shí)驗(yàn)完成的核心步驟與關(guān)鍵注意事項(xiàng)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)——樣品制備與染色流程

流式細(xì)胞術(shù)是分析懸浮細(xì)胞表面標(biāo)志物、細(xì)胞周期、凋亡狀態(tài)等特性的重要工具。懸浮細(xì)胞因無(wú)需消化，樣品制備更為簡(jiǎn)便快捷。

1. 樣品制備

首先收獲細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸浮液。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和體積，將懸液轉(zhuǎn)移到96孔板、試管或Falcon流式管中。需注意的是，如果細(xì)胞未經(jīng)任何處理直接上機(jī)檢測(cè)，所有步驟應(yīng)在冰上操作，并使用4℃預(yù)冷的試劑，以防止細(xì)胞表面蛋白的內(nèi)化。

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢查

確定細(xì)胞總數(shù)并檢查細(xì)胞活力。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞存活率應(yīng)達(dá)到90%~95%方可進(jìn)行流式分析。如果用于凋亡檢測(cè)，則需在染色后盡快完成檢測(cè)，通常宜在1小時(shí)內(nèi)完成。

3. 細(xì)胞洗滌與重懸

在4℃下以約200g離心5分鐘，棄上清后，在冰冷的懸浮緩沖液中重懸細(xì)胞沉淀。推薦的懸浮細(xì)胞濃度為0.5-1×10?個(gè)/mL。離心力和時(shí)間可能需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行優(yōu)化——應(yīng)充分離心以便去除上清液，但離心力不宜過(guò)大，以免細(xì)胞難以重懸。

注意：較高細(xì)胞濃度可能會(huì)堵塞流式細(xì)胞儀系統(tǒng)并影響分辨率。

4. 活細(xì)胞/死細(xì)胞染色（活力染料）

死細(xì)胞容易與抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，必須在分析時(shí)排除?；盍θ玖希ㄈ?/span>7-AAD、DAPI等）無(wú)法穿透活細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，只能對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色。

染色步驟：根據(jù)制造商說(shuō)明，在4℃避光條件下用活力染料孵育細(xì)胞。選擇發(fā)射光譜不與免疫染色所用熒光團(tuán)重疊的染料。染色后，用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞兩次（200g離心5分鐘，4℃），每次洗滌后重新懸浮沉淀。

注意：DAPI等活力染料不能用于固定細(xì)胞后的活/死染色，因?yàn)楣潭ㄟ^(guò)程會(huì)損害所有細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致假陽(yáng)性。此時(shí)應(yīng)使用胺反應(yīng)性可固定細(xì)胞活力染料

5. 抗體標(biāo)記

將細(xì)胞重懸后，加入相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)抗體，孵育后洗去未結(jié)合的抗體，用流式PBS重懸細(xì)胞于流式管中，即可上樣分析。

6. 流式樣品制備關(guān)鍵要點(diǎn)

防止細(xì)胞損傷：避免出現(xiàn)氣泡、劇烈渦旋、更換緩沖液時(shí)吸出全部溶液以及過(guò)度離心

細(xì)胞染色后須盡快完成檢測(cè)，通常宜在1小時(shí)內(nèi)完成-

將熒光團(tuán)保存在黑暗中以避免光漂白

懸浮細(xì)胞RNA提取——Trizol法完整操作流程

懸浮細(xì)胞在RNA提取中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)——無(wú)需胰酶消化，可直接離心收集，避免了消化過(guò)程對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響。

1. 細(xì)胞收集與裂解

將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫下以1000 rpm離心6分鐘，棄去上清。參考不同來(lái)源方法，也可采用12000 rpm 4℃離心2分鐘收集細(xì)胞，之后用預(yù)冷的1×PBS清洗兩次-。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，可直接用吸管或移液槍吹打培養(yǎng)瓶壁，使細(xì)胞充分懸起，然后離心去上清，不需要用PBS提前洗滌-。隨后加入Trizol裂解液，每5-10×10?個(gè)細(xì)胞加入1ml Trizol，反復(fù)用移液槍吹打或劇烈震蕩以裂解細(xì)胞。

2. 相分離

將混合好的樣品全部移至1.5ml EP管中，室溫靜置5分鐘。加入0.2ml氯仿（每1ml Trizol），蓋好管蓋，劇烈振蕩（上下顛倒）15秒，室溫靜置2-3分鐘。

2-8℃下以10500 rpm離心15分鐘。此時(shí)樣品分為三層：上層無(wú)色水相含RNA，中間層為蛋白質(zhì)，下層有機(jī)相含DNA。小心取上層水相（約0.5-0.55ml）移至新的離心管中，注意不要觸及中間界面。

3. RNA沉淀與洗滌

在上清中加入等量的異丙醇，顛倒混勻5次，室溫靜置10分鐘。2-8℃下以10500 rpm離心10分鐘，棄上清，可見(jiàn)RNA沉淀于管底。

加入1ml75%乙醇洗滌沉淀，輕輕彈起管底，2-8℃下以8500 rpm離心5分鐘，棄上清。

4. RNA溶解與保存

將EP管敞開(kāi)放在濾紙上，管口朝向酒精燈方向，室溫干燥（注意不要完-全干燥，否則RNA不易溶解）。用DEPC水溶解RNA（約30μl），分裝后取2μl電泳檢測(cè)完整性、2μl進(jìn)行濃度測(cè)定，其余分裝保存于-20℃備用。

5. RNA提取關(guān)鍵注意事項(xiàng)

l 防止RNase污染：全程戴好口罩和手套，使用無(wú)RNase的槍頭、離心管等耗材

l 試劑安全：Trizol含有酚等有害物質(zhì)，注意個(gè)人防護(hù)，操作應(yīng)在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行

l 細(xì)胞裂解充分：確保移液管反復(fù)吹打直至細(xì)胞完-全溶解

l 避免DNA污染：相分離時(shí)切勿吸取中間蛋白層和有機(jī)相

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