貨號(hào)： HG-CL200

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本試劑盒用于生物制品樣本前處理，精準(zhǔn)抽提各種生物制品中宿主細(xì)胞殘留DNA。本試劑盒適用于多種基質(zhì)緩沖溶液，有效 提取純化微量的DNA?？膳c譜新支原體DNA檢測(cè)試劑盒配合使用。

規(guī)格：

100人份

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品儲(chǔ)存條件與有限期：

規(guī)定儲(chǔ)存條件下12個(gè)月。

試驗(yàn)所需自備器材和試劑

無(wú)水乙醇（分析純）、1×PBS緩沖液（無(wú)Mg2+和Ca2+，除菌過(guò)濾，pH7.4）、異丙醇（分析純）、5M NaCl、1M NaOH、 1M HCl；

渦旋儀、磁力架、迷你離心機(jī)、高速離心機(jī)、水浴鍋/金屬浴、移液器；

1.5mL無(wú)菌低吸附離心管、低吸附吸頭、一次性手套。

試驗(yàn)所需自備器材和試劑

試驗(yàn)準(zhǔn)備

1、每次試驗(yàn)需要在干凈的試劑瓶中用無(wú)水乙醇和滅菌的超純水配制成新鮮的80%乙醇。 

2、單個(gè)樣本的工作結(jié)合液的準(zhǔn)備：200µL結(jié)合液+9µL糖原+0.2µL酵母tRNA（如果提取酵母DNA，結(jié)合液中不加酵母 tRNA）。   

3、洗滌液準(zhǔn)備：洗滌液使用前加30mL的無(wú)水乙醇，充分混勻后使用，同時(shí)做好標(biāo)記，每次使用后將瓶蓋蓋緊，以保持瓶中 的無(wú)水乙醇含量。 

4、5M NaCl 準(zhǔn)備：稱取1.4625g NaCl，加入5mL滅菌過(guò)的超純水搖勻，建議分裝保存。 

5、水浴鍋/金屬浴準(zhǔn)備：65℃和70℃兩個(gè)溫度。

樣本準(zhǔn)備

1、樣本稀釋：如果待檢測(cè)樣本是生物制品純化過(guò)程中的上游中間樣本，可能含有較高的DNA含量。為了保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性， 使樣本的檢測(cè)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)，可以用1×PBS緩沖液對(duì)高DNA含量樣本進(jìn)行適當(dāng)比例稀釋后再進(jìn)行樣本提取，一般 可考慮將高DNA含量樣本稀釋100倍或1000倍。 

2、干粉樣本： 一般可考慮將干粉樣本稀釋成10mg/mL或100mg/mL，再進(jìn)行提取操作。 

3、pH值要求：使用1M NaOH或1M HCl調(diào)整樣品的pH至中性（pH6.0~8.0）進(jìn)行提取。 

4、平行處理：每個(gè)樣本建議進(jìn)行三次DNA提取處理。 

5、樣品加標(biāo)：待處理樣品的DNA加標(biāo)濃度為樣品核酸濃度的2-10倍為宜，建議樣品加標(biāo)體積不超過(guò)待處理樣本體積的 1/10。 

6、陰性對(duì)照：每次試驗(yàn)需用無(wú)模板稀釋液（1×PBS緩沖液或DNA稀釋液）與待測(cè)樣本一同處理。

操作流程

1、每個(gè)待處理樣本取100µL于1.5mL離心管中，待進(jìn)一步提取。 

2、每個(gè)100µL樣本中加入10μL 5M NaCl、100μL裂解液和10μL蛋白酶K，渦旋震蕩30s，瞬時(shí)離心，65℃孵1h。 

注：?jiǎn)蝹€(gè)樣本所需蛋白酶K及裂解液的用量需根據(jù)樣本蛋白濃度進(jìn)行調(diào)整，具體如下表

接下來(lái)操作步驟分為手動(dòng)提取和機(jī)器提取，用戶可根據(jù)需要選擇相應(yīng)的提取方式進(jìn)行操作。

手動(dòng)提取

3、孵育完成后將離心管瞬時(shí)離心，之后依次加入209.2μL工作結(jié)合液、250μL異丙醇和20μL磁珠（磁珠使用前需充分混勻， 確保每次加入的磁珠量均一致，以免造成DNA得率不一致），渦旋振蕩10min，快速離心10s。

4、將離心管置于磁力架，輕輕地左右轉(zhuǎn)動(dòng)，待磁珠聚集于貼近磁力架的管壁后，保持離心管固定于磁力架上，用移液槍吸去 上清，注意不要觸碰磁珠。

5、加入500μL洗滌液（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），渦旋振蕩30s，確保磁珠分散，離心管壁無(wú)聚集磁珠?？?速離心10s后將離心管重新置于磁力架上輕輕地左右轉(zhuǎn)動(dòng)，待磁珠聚集于貼近磁力架的管壁后，靜置1min，用移液器小心吸去上清。 

6、加入500μL新鮮配制的80%乙醇，渦旋振蕩30s，確保磁珠分散，離心管壁無(wú)聚集磁珠。快速離心10s后將離心管重新 置于磁力架上輕輕地左右轉(zhuǎn)動(dòng)，待磁珠聚集于貼近磁力架的管壁后，靜置1min，用移液器小心吸去上清。 

7、為保證盡量吸出殘留乙醇，可將離心管快速離心10s后，置于磁力架上用10μL移液器吸出殘留乙醇。 

8、打開(kāi)管蓋室溫干燥3-5min（干燥時(shí)間依具體情況進(jìn)行延長(zhǎng)或縮短；肉眼隨時(shí)注意觀察，避免磁珠過(guò)分干燥）。   注：干燥過(guò)程中磁珠過(guò)干或有乙醇?xì)埩舳紩?huì)影響樣本回收率。干燥也可選擇鼓風(fēng)干燥，一般建議鼓風(fēng)干燥2min。 

9、將離心管從磁力架取下，每管加入100μL洗脫液，渦旋振蕩1min，70℃孵育7min，期間每2-3min渦旋混勻一次。 

10、孵育完成后，將離心管高速離心1min，然后靜置于磁力架上，待磁珠分離后，用移液器小心轉(zhuǎn)移上清到新的1.5mL離 心管中。

機(jī)器提取 （以下僅供參考，需結(jié)合核酸自動(dòng)i提取儀的具體操作流程）

3、孵育完成后將離心管瞬時(shí)離心。按照下述 96 深孔板排布預(yù)先加入相應(yīng)溶液，其中：

• 第3或9列：工作結(jié)合液209.2μL/孔、異丙醇250μL/孔、磁珠20μL/孔及經(jīng)消化后的樣本。 

• 第4或10列：洗滌液500μL/孔。 

• 第5或11列：80%乙醇500μL/孔。 

• 第6或12列：洗脫液100μL/孔。 

注：第3或9列可在其他列試劑全部加完后再加。

4、將儀器電源插頭插入220V交流電源，儀器開(kāi)機(jī)后顯示初始界面，幾秒鐘后儀器進(jìn)入自檢狀態(tài)。整個(gè)開(kāi)機(jī)和自檢過(guò)程需 1~2 min。

5、根據(jù)需求進(jìn)入三級(jí)管理系統(tǒng)的不同層級(jí)，點(diǎn)擊窗口上部的“運(yùn)行"進(jìn)入運(yùn)行界面，點(diǎn)擊紫外燈按鈕開(kāi)關(guān)進(jìn)行紫外線消毒。

6、打開(kāi)儀器前視窗門，拉出托盤至最外側(cè)，將加好樣的96孔深孔板放入儀器中固定位置，放置孔板時(shí)須注意其方向(A1位 置為左前位置），將托盤推入最內(nèi)側(cè)，把磁力套依次插入磁架T型槽內(nèi)，關(guān)閉儀器前視窗門。點(diǎn)擊窗口上部的“流程庫(kù)"選擇相 應(yīng)的程序。點(diǎn)擊“編輯"，根據(jù)需要修改純化過(guò)程中的時(shí)間、溫度、溶液體積等參數(shù) 

7、程序確認(rèn)無(wú)誤后，點(diǎn)擊窗口上部的“運(yùn)行"進(jìn)入運(yùn)行界面，點(diǎn)擊“開(kāi)始"按鈕，啟動(dòng)流程開(kāi)始運(yùn)行，儀器會(huì)自動(dòng)進(jìn)行處理 直至完成。   注：運(yùn)行前再次檢查磁力套是否插入磁架T型槽內(nèi)。 

8、運(yùn)行完成后，拿出96孔深孔板及磁力套。從對(duì)應(yīng)孔中取出純化完成的樣本洗脫液，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。 注：若純化完成的樣本洗脫液中殘留磁珠，可將核酸純化液再次高速離心3min，將離心管靜置于磁力架上，放置2min，待 溶液澄清用移液器小心轉(zhuǎn)移上清至新1.5mL離心管中。 

9、點(diǎn)擊窗口上部的“運(yùn)行"進(jìn)入運(yùn)行界面，點(diǎn)擊紫外燈按鈕開(kāi)關(guān)進(jìn)行紫外線消毒，注意關(guān)閉儀器前蓋。消毒結(jié)束后，關(guān)閉儀器。

注意事項(xiàng)：

1、實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，為減少污染建議用酒精擦拭臺(tái)面、移液器、槍頭盒等表面。
2、注意在不同加樣步驟間及時(shí)更換吸頭，避免交叉污染。建議使用帶濾芯的槍頭。
3、離心機(jī)：選擇升降速快的離心機(jī)，防止離心不充分導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗（尤其是老化的離心機(jī)，還有污染的可能性）。
4、所有試劑需平衡至室溫，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
5、首i次使用前，請(qǐng)按照試劑瓶上標(biāo)簽，在洗滌液中加入指i定體積的無(wú)水乙醇，充分混勻后使用，同時(shí)做好標(biāo)記，每次使用 后將瓶蓋蓋緊，以保持瓶中的無(wú)水乙醇含量。
6、在每一步操作時(shí)，用左手順時(shí)針?lè)较颦h(huán)握EP管，大拇指輕輕打開(kāi)管蓋，勿將液體濺出。
7、在磁性分離架上分離磁珠時(shí)，中途可以適當(dāng)旋轉(zhuǎn)離心管，使磁珠吸附更加集中。
8、在磁珠洗滌或洗脫過(guò)程中，每次振蕩混勻后，都要短時(shí)間快速離心，以保證沒(méi)有磁珠液附著在離心管管蓋和管壁上。
9、盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化就立即進(jìn)行后續(xù)DNA檢測(cè)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 

10、試劑應(yīng)儲(chǔ)存于規(guī)定環(huán)境下，不同批次試劑盒試劑不建議混用。
11、最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。

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